生物納米顆粒，比如病毒以及細胞外囊泡(EVs)，作為醫(yī)學(xué)生物標志物以及疾病進展的調(diào)節(jié)劑備受關(guān)注，參考Journal of Extracellular Vesicles雜志的影響因子就可見一斑，2018年的影響因子已經(jīng)飆升到11，然而外泌體以及較小的病毒顆粒由于直徑較小，在流式圖上往往與背景噪音重合，而無法被傳統(tǒng)流式所檢測，為了從單個顆粒水平鑒定和分選，從而研究不同亞群的EVs，以美國國家癌癥中心疫苗研究所(NCI Vaccine Branch)專家為首的研究人員推薦了一種納米流式分析和分選方法(定義為nanoFACS)，從而實現(xiàn)了EVs的高速度(>70000 events/s)、高純度(>95%)、高特異性和高活性分選，其高活性體現(xiàn)在分選后的EVs保留了完整的形態(tài)，表面蛋白特性以及所攜帶的RNA cargo活性

一、EVs研究，合適流式細胞儀的尋找(作者心目中)

由于EVs直徑較小，外泌體甚至低于150nm，傳統(tǒng)基于石英杯激發(fā)(jet-in-cuvette)的流式分選儀器散射光檢測極限都在200nm，所以作者認為靈敏度更高的流式儀器是基于空氣式激發(fā)(jet-in-air)，因此選擇了市面上散射光分辨率能達到100nm的4種流式儀器，包括Partec CyFlow、BD Influx with SPD(SPD為FSC small particle detector ，即小顆粒檢測模塊)和貝克曼Moflo XDP(NanoView即小顆粒檢測模塊)以及Moflo Astrios EQ，考慮到下表對比中Moflo Astrios EQ所具備的超高分辨率以及擁有的極速電子處理系統(tǒng)，最后作者選取了Moflo Astrios EQ作為nanoFACS 方法學(xué)中EVs分析和分選的流式設(shè)備

二、nanoFACS儀器的設(shè)定

1. 儀器配置：5激光MoFlo Astrios EQ (355, 405, 488, 561 and 640 nm);40nm鞘液過濾器;具備405, 488, 561 和 640 nm激光的SSC檢測器模塊

2. 前向檢測器的調(diào)節(jié)：如為雙前向儀器，去除dual-PMT beam splitter 和ND濾片，前向插上P1 mask

3. 儀器獲取設(shè)置：閾值triggering threshold設(shè)置在561nnm 激光的SSC通道，數(shù)據(jù)分析使用488nm激光的SSC通道

4. 儀器分選設(shè)置：drop drive frequency 70–95 kHz, plate voltages 3000–4000 V以及relatively low amplitudes 8–15 V

5. Reference noise 設(shè)置：儀器的背景噪音，一部分源于激光和液流正交時散射光中未被bar擋掉的一部分折射光，如下圖，作為nanoFACS方法中的一個重要助手，作者認為設(shè)置為儀器最大上樣速度的10–20%比較合適，可以更好分辨小顆粒

三、實驗結(jié)果呈現(xiàn)

1. 最佳閾值設(shè)置通道的選擇通常我們做常規(guī)細胞實驗，散射光閾值通道設(shè)置都會選擇488nm激光FSC或SSC，一方面是市面流式在散射光閾值設(shè)置通道上只提供488nm激光的FSC和SSC，另一方面是因為對于足夠大的細胞來說已經(jīng)足夠，而對于EVs來說，由于顆粒太小，為了獲得EVs與背景噪音更好的分辨率，MoFlo Astrios EQ提供了不同激光的SSC作為閾值設(shè)置通道，下圖b為閾值通道分別設(shè)置在488nm激光的SSC、561nm激光的SSC以及488nm熒光通道下100nm微球與背景噪音的分離指數(shù)，圖知561nm激光SSC作為閾值設(shè)置通道為最佳，其最后結(jié)果圖如圖a，分群非常清晰

2.CFSE標記的EVs分析檢測

為了檢測納米流式MoFlo Astrios EQ在生物來源納米顆粒的檢測能力，作者用CFSE標記DC細胞來源的 (DC2.4) EVs，上流式檢測如下圖，可見絕大部分的EVs能夠與背景噪音明顯區(qū)分，CFSE標記后的EVs在熒光和散射光二維圖上則更為明顯

作者同時借助計數(shù)微球?qū)σ陨螮Vs進行計數(shù)，下圖e為粒度儀(Nanoparticle tracking analysis)下的EVs直徑分布，圖f為MoFlo Astrios EQ(5個重復(fù)樣)和粒度儀(3個重復(fù)樣)得出的EVs濃度相關(guān)性，表明MoFlo Astrios EQ與粒度儀的結(jié)果一致性較高

3. 腫瘤和免疫細胞來源的EVs高速分選

作者下一步借助 CFSE 和Cell-Trace violet 染色，評估MoFlo Astrios EQ高速分選EVs的能力，標本為免疫細胞 (DC2.4, immature mouse dendritic cells) 和腫瘤細胞系 (4T1, mouse mammary carcinoma) ，下圖d和e分別通過WB和粒度儀驗證了DC2.4和4T1細胞來源的EVs蛋白表達和粒徑分布，圖f則借助電鏡觀察了分選前DC2.4來源EVs的形態(tài)，以上實驗均是驗證分選前的樣本中EVs的存在

通過Cell-Trace Violet 標記的DC2.4 EVs 和 CFSE標記的4T1 EVs 經(jīng)過混合后通過流式的純度模式分選，分選速度為75,000 events/s，其設(shè)門邏輯如下

通過流式檢測后如下圖a，EVs與背景噪音區(qū)分明顯，圖b上方為分選前的背景噪音和混合的EVs，圖b下方則為分選后的DC2.4 EVs 和4T1 EVs再次分析，從圖可知分選后的樣本并無嚴重的其他門內(nèi)顆粒污染

4. 細胞形態(tài)完整且具備功能性的EVs高速分選驗證

EVs作為細胞間的媒介，是具備生物活性的顆粒，在細胞間傳遞信號分子影響細胞的生理代謝，所以如同我們常規(guī)流式分選一樣，有些老師分選后的細胞是活的但是由于分選后受損傷已無功能，無法完成后續(xù)實驗，EVs同樣如此，分選后的EVs是否具備有功能性的蛋白和RNA Cargo至關(guān)重要

作者選取BaL(a CCR5-tropic HIV strain)和NL4.3(a CXCR4-tropic strain)兩種病毒顆粒，選取的理由為這兩種病毒借助不同的共同受體實現(xiàn)宿主細胞的入侵以及靶細胞的感染，即Bal病毒只能感染具備CCR5受體的靶細胞，因此分選后的病毒顆粒去感染靶細胞，該模型可以驗證分選過程對病毒顆粒是否帶來損傷，如果損傷則無法成功感染靶細胞PKH26 (red) 標記的 BaL病毒顆粒和 PKH67 (green) 標記的NL4.3病毒顆粒等量混合后上流式，結(jié)果如下圖，圖a為散射光圖上病毒顆粒與背景噪音的清晰分群，圖b上方為分選前的EVs，圖b下方為分選后回測的EVs，圖c為回測的純度統(tǒng)計，純度均高于94%

下圖綠色圈內(nèi)分別為分選前和分選后電鏡下的EVs，可見分選后的EVs形態(tài)完整，紅色圈內(nèi)為分選后的Bal病毒顆粒分別感染具備CCR5受體的U373-MAGI-CCR5和CXCR4受體的 U373-MAGI-CXCR4 細胞，由于Bal病毒顆粒親和受體為CCR5，所以可見紅圈內(nèi)上圖CCR5+細胞形成明顯的藍色β-Gal顯色，表明分選的Bal病毒具備生物活性，分選過程并沒有對病毒顆粒造成明顯的損傷，同理見藍色圈內(nèi)的NL4.3病毒顆粒成功感染CXCR4+細胞

5. EVs表面的腫瘤和免疫細胞標志物檢測

EVs作為一個異質(zhì)性的群體，包括外泌體和細胞微泡，因此單個EVs水平的鑒定分類有助于更好的理解EVs，包括蛋白的表達以及EVs的來源等。作者以PC3-pip 細胞系和bone marrow-derived dendritic cells (BMDCs)來源的EVs為研究對象，分別分析其表面前列腺癌特異性膜抗原(PSMA)和MHC II 抗原表達，其中The PC3-pip 細胞系被工程化改造表達PSMA抗原下圖的實驗結(jié)果表明，PC3-pip-EV 和 BMDC-EV在488nm散射光 SSC上與背景噪音明顯分群，同時FITC和PE標記的PSMA和MHCII，在對應(yīng)熒光通道均有熒光明顯增強(注X軸的單位為Joshua A. Welsh模型下的熒光強度值轉(zhuǎn)化為MESF值)，說明EVs表面相關(guān)抗原的表達

文章的討論環(huán)節(jié)，作者認為其描述的nanoFACS方法學(xué)不同于其他學(xué)者描述的納米級流式分析法，主要在以下幾點

1)即使熒光參數(shù)整合在nanoFACS中，但nanoFACS不需要以熒光作為閾值設(shè)置通道，憑借靈敏度更高的散射光參數(shù)作為閾值，可以更為完整的分析和分選EVs中的不同亞群

2) 傳統(tǒng)流式由于散射光分辨率不夠，需要借助微球吸附EVs，而nanoFACS不需要微球，依靠合適的 樣本稀釋以及儀器配置，即可將EVs單個顆粒和背景噪音區(qū)分，相比于微球吸附EVs，nanoFACS更直接，也更有助于更好保留EVs的顆粒特性以及生物學(xué)功能

3)nanoFACS具備高速分析和分選各類生物以及無機納米顆粒的能力，且分選后的顆粒具備高度功能活性。同時據(jù)作者的了解，nanoFACS 是第一次流式方法學(xué)上 驗證了納米顆粒的functional vesicular structure, protein和RNA

4)nanoFACS 利用流式檢測極限下的背景噪音作為閾值設(shè)置參考，有助于研究和評價散射光較弱的納米顆粒，而這類顆粒在傳統(tǒng)流式儀器上由于無法與背景噪音有效分辨而無法被檢測流式分選是分析和鑒定生物顆粒(細胞或者EVs)的重要工具，最后，作者對自己提出的nanoFACS 提出了希望，希望nanoFACS方法學(xué)作為將來研究exosomes, viruses, microvesicles, and other submicron biomaterials的有用工具